六年前，负责为Ping Yeh治疗的肿瘤科医生告诉他，他的霍奇金淋巴瘤对标准的化疗方案有耐药性，他需要一种更有效的七药鸡尾酒疗法。这种治疗使他的癌症得到了缓解，但之后Yeh需要进行超声波检查，看看这种治疗是否损害了他的心脏（该疗法对于部分患者是有心脏毒性的）。

   “这种治疗的确治愈了我，但它也可能在治愈我的同时杀死我。”Yeh解释说，这是一次非常可怕的经历，它让我思考是否有更好的方法来检测药物安全性。2014年，Yeh在明尼阿波利斯与人合作创办了StemoniX公司，目的是将工程、制造和人体干细胞方面的进展结合起来，开发与人体生理学更具相似性的药物筛选和测试平台。

   幸运的是，Yeh的心脏有惊无险。不幸的是，像Yeh这样的病人经常遇到有毒或无效的药物，因为在药物进入病人体内之前用于测试药物的动物模型在很多方面都是不完美的。在所有进入临床试验的药物中，只有大约10%最终获得批准(1)，其余90%的药物在试验中失败——原因包括药物脱靶、不良反应和剂量问题、低效或无效，以及最糟糕的情况“毒性”。

   “你越是可以更好地模拟人体的情况，就越是可以更好地的研究和理解疾病的基本病理，同时也能更好地预测药物的疗效和毒性,” Richard Eglen说。他是位于马萨诸塞州波士顿的康宁188体育平台的副总裁兼总经理。

   然而，现在面临的挑战是研究人员们需要设计出比当前策略具有显著优势的模型。这意味着要建立能够提供可靠、可重复数据的模型，同时在生物学上能帮助预测人体试验的效果，而且不会大幅增加成本。StemoniX、康宁和其他几家公司正在尝试用创新的方法来应对这一挑战。

 

细胞培养的高级结构

 

   培养方法不断改进，现在已经产生了三维细胞培养、球状体，甚至更复杂的类器官，能更准确地模拟人体组织。康宁公司率先为研究人员提供了培养这些细胞的最好表面材料。现在，该公司推出了1536孔的球状体板，可以配合最高水平的自动化筛选平台工作。底部为圆形的孔，其内壁涂有一层超低的附着表面，促使孔内的细胞相互聚集，形成球状体。

   “这将使研究人员能够进行超高通量筛选，每天可筛选多达10万种化合物，”Eglen说。这些板具有很小的孔体积，因此产生微小的球状体，范围从500到2000个细胞。它们提供与细胞数量成线性关系的可重复响应。

   位于加州拉荷亚的斯克里普斯研究所的一个课题组已经在使用带有胰腺肿瘤球状体的平板，来识别这些细胞RAS致癌突变基因的抑制剂。以二维细胞培养为基础的平行筛选并没有发现相同的抑制剂(2)。康宁自己的研究使用人类肝球状体对已知的肝毒素进行筛选，结果表明它们可以用于筛选肝脏毒性化合物。Eglen说：“每个人都希望在给病人用药之前能够更好地预测药物的代谢情况。”

   康宁公司还开发了另一项技术来支持间充质干细胞（MSCs）的三维培养。研究人员希望将MSCs（也称为成人干细胞）开发成个性化的、基于患者细胞的治疗方法，例如替换糖尿病中有缺陷的、用于产生胰岛素的胰岛细胞等。但是在原有条件下培养出足够的间充质干细胞来，并将细胞送回病人体内是一个挑战。康宁公司的易消化微载体技术使用惰性，非动物来源的聚合物制造微载体表面，从而使细胞以三维形态在这些位于培养液中的表面上生长。然后，通过添加酶，微载体可以被溶解，只留下MSCs以便进行分离。

 

人体细胞量产

 

   StemoniX提供成品化的二维微心脏和微脑板，以及微脑三维球状体板，用于高通量筛选，以提供精确的人体组织反应测试。该公司选择将重点放在脑和心脏细胞上，部分原因是神经毒性和心脏毒性是药物在临床试验中安全性失败的两个最主要原因。

   微心脏中的细胞沿着微通道生长，形成类似于心脏肌肉的肉瘤单元结构，具有完整的物理标记、可形成正确的离子通道，并进行单向收缩。

   二维和三维微脑中的细胞是星形胶质细胞和神经元的混合物，它们形成突触和基本的神经网络。二维培养是测量细胞形态变化的关键，比如神经投射。三维球状体培养很难可视化，但它们表现出自发的、同步的神经放电，可以定量筛选影响放电的药物反应。同样，心肌细胞的收缩也可以定量测定药物反应，如心律失常。

   “没有一个模型是完美的，”Yeh承认，但是他发现StemoniX的心脏和脑模型非常有用，“因为它们是人类细胞，结构正确，容易测量，并且以转基因动物的一小部分成本提供更具预测性、更可靠和可重复的数据。”

 

微环境模拟

 

   微图案允许研究人员通过控制特定图案或梯度下的信号分子，或生长因子来增加细胞培养的复杂性，但与在完整的动物模型中相比，这种方法对信号的影响更加容易控制。

   虽然微图案技术已经可以用于二维细胞培养，但目前的技术在设计梯度或分层两个以上蛋白质方面还很粗糙。其中一种技术是微接触打印，它使用浸在蛋白质溶液中的微型印章将蛋白印在培养物表面上，但在打印特定数量或排列方式的蛋白质时不够精确。为了解决这些局限，法国国家科学研究中心（CNRS）的三位研究人员想出了PRIMO，一种用于微图案的非接触式、无掩模技术，并建立了Alvéole公司。

   PRIMO是基于光诱导的蛋白质分子吸附技术（LIMAP），并结合了一个UV照明系统和光活性试剂。PRIMO的机箱可以附在倒置显微镜上，它包含一个紫外激光器和微镜放映机。通过显微镜的物镜，计算机里的任何图像文件都可以被它以1.2微米的分辨率投影到细胞培养板的表面上。

   载玻片、盖玻片、塑料板、水凝胶等均可先用聚乙二醇（PEG）作为防污剂处理，然后在溶液中加入PLPP光引发剂。当与选择投影图案中的紫外线相遇时，PLPP会降解聚乙二醇，留下一个“凹槽”，由选择的蛋白质填充。PRIMO的Leonardo软件可以控制显微镜电动载物台的移动，从而调整或切换图案。此外，使用该软件的256灰度级来改变紫外线强度让研究人员能够控制多少PEG被降解，从而控制多少蛋白质附着在表面。

   在三维应用中，覆盖在涂膜上的蛋白质微图案可以转移到水凝胶的表面，因为直接用紫外线照射水凝胶可以改变其硬度。研究人员还使用PRIMO涂覆在聚二甲基硅氧烷聚合物微球的底部和侧面，以特定的三维结构培养肝细胞。另一个课题组还使用PRIMO将人类诱导多能干细胞（hiPSCs）培养成星形胶质细胞，并沿着细长的直线排列，以测量患有神经退行性疾病Rett综合征患者的微管生长动态(3)。

   “使用PRIMO，我们可以帮助研究团队在短短几周内尝试获得不同形状和宽度的线条——而使用其他微图案技术则需要几个月的时间，”巴黎Alvéole公司的运营营销经理Marie-Charlotte Manus说。

   Manus说，这一系统还不能很好地用于高通量成像或筛选，尽管该公司正在开发一种用于多孔板的版本。目前，研究人员可以利用PRIMO更好的模拟体内微环境，即通过优化他们中细胞培养中遇到的微图形。

 

更精确的CRISPR模型

 

   基因编辑技术将人类细胞培养带到了一个全新的基因操作水平上，无论是对转化细胞系、病人来源的原代细胞，还是诱导多能干细胞。虽然科研领域从伦理上无法接受制造基因敲除的人类，但像CRISPR/Cas9这样的技术可以让研究人员快速的从培养的人类细胞中敲除特定基因，然后筛选所需的特性。

   “在后基因组时代，我们可以用以前从未想过的方式来审视生物系统，”英国剑桥Horizon Discovery公司的功能基因组筛查部门负责人Benedict Cross说。“从整个基因组的角度来看，系统方法很难在整个动物中合理控制。”

   Horizon Discovery的CRISPR基因敲除筛选平台可以敲除人类细胞群体中与特定过程（如凋亡）相关的每一个基因或一系列基因，然后测量这些被改变的细胞对药物化合物的反应。它可用于识别新的药物靶点，发现与药物敏感性或耐药性相关的基因，或选择最适合进行临床试验的患者。

   每一个CRISPR敲除引导RNA都针对它敲除的基因编码了一个独特的条形码，所有的细胞都作为敲除的混合种群保存在一起，无论它们是在二维单层、三维球状体中，还是悬浮状态生长。一组细胞接受实验性治疗，如药物，另一组作为对照。处理后的细胞被分离出来，并对其条形码进行测序，以揭示其缺失的基因。

   “在这一点上，它是相当精确和定量的，”Cross说。基因条形码的频率越高，该基因的抑制作用就越有可能导致所需的生物活性。“这是一个全基因组水平分析的表型筛选。”

   Horizon还调整了CRISPR/Cas9系统，创建了另外两个筛选平台：CRISPR干涉（CRISPRi）和CRISPR活化（CRISPRa）。CRISPRi降低了基因表达水平，但没有完全清除，而CRISPRa提高了目标基因的表达。

   这三个CRISPR筛选平台可以同时用于研究相同基因的敲除、功能丧失和功能获得。Cross说：“当你能够从两个方向观察，发现内源性激活和抑制某个通路的基因时，研究一个生物过程的能力就会得到极大的提高。”

 

基因编辑动物

 

   通过2014年收购Sigma Advanced Genetic Engineering（SAGE）公司， Horizon Discovery还利用CRISPR技术，制作改良的“人源化”大鼠模型，用于药物发现和安全测试。

   正如位于密苏里州圣路易斯市的Horizon Discovery体内研发小组的负责人Kevin Forbes所解释的那样，小鼠模型在药物研发领域的崛起，与利用胚胎干细胞（ESC）技术进行基因敲除的易得性有关。然而，在此之前，大鼠是首选的模型，因为它们更大的体积允许多次抽血和更长期的化合物研究，而且它们的亲社会行为和较慢的新陈代谢在生物学上更接近人类。

   Horizon Discovery现在可以制作定制化的基因编辑大鼠、小鼠和兔子模型，修改范围从小的点突变到大的片段缺失，包括敲出—敲入模型，在这个模型中，动物基因被人类基因取代。Horizon Discovery还拥有成品化的敲除大鼠模型，用于毒理学、肿瘤学和心血管疾病研究，以及研究神经疾病(包括自闭症、帕金森病和阿尔茨海默病)的模型。

   一个大鼠模型可以用来做药物吸收、分配、代谢、排泄和毒理学（ADME/Tox）的研究，因为它经过基因编辑去除了大鼠三种核受体PXR、CAR、AHR和主要的药物代谢酶细胞色素P450 CA4。这些受体起着异种感受器的作用，启动细胞色素P450基因来代谢“外来”药物。在这些ADME/Tox大鼠中，这四个基因的人类版本被重新编入。从理论上讲，这些老鼠应该像人类小肠和肝细胞检测药物，以启动代谢一样发现新的药物。

   Forbes将CRISPR/Cas9描述为一种更高效、更快速的方法。与基于ESC技术的转基因方法相比，在制造复杂的转基因模型(如ADME/Tox大鼠)方面，估计CRISPR可使这一过程缩短一年。

   这些“人源化”的大鼠将很快为临床前药物安全测试提供一个全动物解决方案，这比在体外用人类肝细胞进行测试要有用得多。例如，培养的细胞不会获得身体其他部位形成的肿瘤，也不会发生药物引起的心脏或认知问题。

   当然，药物开发可能永远无法脱离对实验动物的使用，因为它们代表了完整器官系统的生物复杂性，Yeh提醒道。但这些新技术将大大减少未来药物测试所需动物的数量和种类。

   随着模型在“人源化”方面的改进，药物开发人员应该能够更好地预测化合物在人体中的作用，从而避免许多候选药物注定面临的失败，并避免像Yeh这样的患者受到伤害。受他最近一次幸免于难的启发，他一直致力于建立更好的药物测试模型：“如果一个模型有足够的正确部分，并且连接正确，那么我们将继续改进其功能。”■

 

参考文献

1. M. Hay et al., Nat. Biotech. 32, 40-51 (2014). 

2. S. Kota et al., Oncogene 37, 4372-4384 (2018); doi: 10.1038/s41388-018-0257-5.

3. C. Delépine et al., Hum. Mol. Genetics. 25, 146-157 (2016); doi: 10.1093/hmg/ddv464.

（译者李楠是188体育app:深圳先进技术研究院的副研究员。）

 

作者Kendall Powell是常驻科罗拉多州拉法叶的自由科学作家。

鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2018年10月12日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.sciencemag.org/features/2018/10/replacing-replacements-animal-model-alternatives。

《科学新闻》 (科学新闻2019年12月刊 科学·生命)